Mikroskopy konfokalne
Mikroskopia konfokalna to technika obrazowania optycznego służąca do zwiększania rozdzielczości optycznej i kontrastu pozyskiwanego obrazu. Osiągane jest to za pomocą kształtowania wiązki, przy użyciu dodatkowej przesłony z otworem do blokowania nieostrego światła oraz poprzez przechwytywanie wielu dwuwymiarowych obrazów próbki, wykonanych na różnych wysokościach, co umożliwia rekonstrukcję trójwymiarowych struktur w obiekcie (proces znany jako "optical sectioning"). Mikroskopy konfokalne są szeroko stosowane w środowiskach naukowych i przemysłowych, a typowe zastosowania to nauki przyrodnicze, inspekcja półprzewodników i materiałoznawstwo.
W konwencjonalnym mikroskopie światło przenika próbkę w całości, bądź tak daleko jak jest w stanie się rozprzestrzenić. Mikroskop konfokalny CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope), natomiast, w danej chwili skupia znacznie mniejszą wiązkę światła na jednym wąskim poziomie głębokości, zapewniając kontrolowaną, bardzo ograniczoną głębię ostrości, by, po oświetleniu w ten sposób całości próbki, dostarczyć obraz o znacznie wyższym kontraście i rozdzielczości optycznej.
Zasada obrazowania konfokalnego została opatentowana w 1957 roku przez Marvina Minsky'ego w celu przezwyciężenia ograniczeń tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych szerokopolowych. W konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym źródło światła równomiernie dostarcza oświetlenia dla próbki, której całość jest wzbudzana w tym samym czasie. Powstająca fluorescencja jest wykrywana przez fotodetektor mikroskopu lub kamerę, jednakże jednocześnie ujmując w tym, w dużej mierze, nie zogniskowaną część tła.
W przeciwieństwie do tego, mikroskop konfokalny wykorzystuje oświetlenie punktowe w optycznie sprzężonej płaszczyźnie tuż przed detektorem, aby wyeliminować nieostry sygnał - z tej konfiguracji właśnie wywodzi się nazwa „konfokalny”.
Wykrywając światło wytwarzane przez fluorescencję jedynie w bardzo wąskim pasie płaszczyzny ogniskowej, rozdzielczość optyczna obrazu, szczególnie w osi głębokości próbki, jest znacznie wyższa niż w przypadku mikroskopów szerokopolowych. Zwiększona rozdzielczość jest jednakże uzyskiwana kosztem intensywności sygnału, gdyż znacząca część światła fluorescencyjnego z próbki jest blokowana w sprzężonej przesłonie, przez co często wymagany jest długi czas ekspozycji. Aby zrównoważyć ten spadek sygnału, intensywność światła wzmacniana jest przez czuły detektor (specjalistyczną fotodiodę lub fotopowielacz), przekształcając sygnał świetlny w elektryczny.
Obecnie używa się głównie trzech typów mikroskopów konfokalnych:
- skanujące laserowe mikroskopy konfokalne (Confocal Laser Scanning Microscopes)
- mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem (Spinning-disk Confocal Microscopes)
- PAM (Programmable Array Microscopes).
Podczas gdy pierwszy typ gwarantuje obrazy najlepszej jakości, to charakteryzuje się długim czasem obrazowania, zazwyczaj o częstotliwości przechwytywania niższej niż 3 klatki na sekundę. Mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem pozwalają natomiast na znacznie szybsze pozyskiwanie obrazów, wystarczające by tworzyć z nich sekwencje filmowe, chociaż zarazem cechuje je gorsza jakość obrazu oraz inne ograniczenia.
